Size Exclusion Chromatography Method for Purification of Nicotinamide Mononucleotide (NMN) from Bacterial Cells

高血糖とNMN

高血糖は世界の3番目の死亡原因で、世界の健康資源の12％以上が糖尿病治療に費やされています。 インスリン抵抗性は、糖尿病の最も一般的な形態である2型糖尿病の基礎です。 最近の動物実験では、NAD +前駆体であるニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）を投与することにより、2型糖尿病を改善する試みが成功したことが報告されています。 しかし、現在この分子は高価格のため、より効率的で費用効果の高い製造方法を求めています。

この作業では、変性移動相（50 mMギ酸）を用いたアイソクラティック溶出を使用して、ポリ（2-ヒドロキシエチルアスパルタミド）（PolyHEA）固定相の共有結合コーティングを施したシリカのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によりNMNを精製する方法を提案します。 SEC法は、シンプルで特許がなく、最小限のスケールアップ作業で工業生産に直接適用できます。 複数のクロマトグラフィーステップの必要性がなくなり、ライセートのろ過と清澄化のステップが簡素化でき、そのため NMNの製造コストが大幅に削減され、NMNの純度が人間での使用に適したレベルまで向上することが期待されます。

NMNで高血糖を防ぐ

高血糖値は、世界で3番目に高い早期死亡の危険因子です。 より一般的な状態である2型糖尿病は、現代の生活、都市化、身体活動の低下、人口の高齢化に伴って増加しています。 血管、心臓、腎臓、神経に影響を及ぼし、最終的には障害や早死につながります。 以前は、インスリン抵抗性と2型糖尿病との関連が認識されていました。 さらに、異常なミトコンドリア機能は2型糖尿病と相関していました。

結果SEC-HPLCによるシングルステップNMNクロマトグラフィー分離SEC-HPLCプロトコルは、浄化された細菌溶解物サンプルと標準NMNを使用して「方法」のセクションで説明されているように実行されました（図1A、C、およびE）。 フォトダイオードアレイ（PDA）データを分析すると、NMNのリテンションタイム（RT）が6分であることがわかりました。

溶解物の他の分子からのNMNの明確な分離が示されています（図1BおよびD）。 ライセートに最も豊富に含まれるコンタミネーションのリテンションタイムは3.5?4分（図1F）で、これは同じRTでNMN標準で同定された不純物ピーク（図1E）に対応します。 260 nmで得られたクロマトグラムは、PDAデータから抽出され、ピーク面積積分による定量に使用されました（図1E）。 正確なNMN定量化のために、「方法」セクションで説明したキャリブレーション方法を使用しました。 相関係数が0.99の2次多項式が得られ（図1G）、NMN濃度が0.03?3.34 g / Lのサンプルをカバーしています。

MNMの製造コストが安くなる

以前に報告された細菌溶解物からのNMN分離のイオン交換法23を再現しようとしても、おそらく細菌溶解物のニコチンアミド（NAM）含有量が高いため、成長培地に基質として1％NAMが補充されて、期待した結果が得られませんでした。 以前に報告されたように、IEC最適化は時間と費用のかかるプロセスであるため、より単純な方法の特定に努力が費やされました。

分析目的でよく使用されるRPクロマトグラフィー（RPC）は、親水性分子が固定相によって十分に保持されないので、親水性分子を分離するための最も望ましい方法ではありませんでした。 以前は、トリプル四重極LC / MS / MS25によるNMN定量に使用されるRPCは、優れた分析定量データを提供していました。 ただし、結果は、RMNを含む対象分子に対応するm / z値のRPC分離および選択的データ取得（多重反応モニタリング）によって得られましたが、他の可能性のある共溶出汚染物質は無視されました。 これは分析定量には十分ですが、分取目的には適していません。

選択イオンモニタリング（SIM）は、共溶出する分子に関するすべての情報を除外するため、分取には不十分でした。 RPCによるNMN標準のさらなる精製は成功しましたが（図4CおよびE）、2つのピーク間の小さなRT差により、メソッドの分取使用が制限され、カラム負荷が高くなるとピークが広がり、分離能が低下しました。 バクテリアライセートに最も豊富に含まれる不純物はNAM（図1Fおよび2D、F）であり、提案されたSECメソッドのNMN標準（図1E）の主な不純物と同様のRTを示したため、 NMN標準で検出された不純物もNAMでした。 したがって、NMN標準のRP溶出（図4CおよびE）の未知のピーク（RT = 4 min）はNAMである可能性があります。

RP分離によって得られたNAMとNMNの両方のピークは、提案されたSEC法から得られたピークよりも広く、収集されたフラクションのNMN濃度が低くなり、汚染物質が共溶出する可能性が高くなりました。

実験が行われました

NMN分離に優れたRTと分離能を提供する最も興味深く最新のRPCメソッドは、多孔質グラファイトカーボンを使用します19,26。 この技術の主な欠点は、この材料の価格が高いため、分取用途での使用が禁止されていることです。 以前に報告された、ホルミン酸抽出、ろ過、それに続く2段階のクロマトグラフィープロセス（ボロン酸親和性とイオンペア24）による全細胞抽出物からのヌクレオチドの分離は、NMNの良好な分離を促進しました。 ただし、これには2段階のクロマトグラフィープロセスという欠点があり、提案された単一段階のSECと比較して費用がかかります。