元論文：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405805X25000523
概要
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は生物学的に重要なヌクレオチドであり、肉、果物、野菜など多くの食品に豊富に含まれています。近年では、その老化抑制効果が注目されています。NMNの合成には化学合成法が一般的ですが、環境への配慮が求められる「グリーン生産」基準には合致しません。これに対し、NMNの生物合成は、安全かつ環境に優しい手法として評価されています。
本論文では、NMN生合成研究を解析するために、「基質–経路–酵素学（substrate-pathway-enzymology）」という新たなフレームワークを提案します。まず、4種類の基質（ニコチンアミドリボース、ナイアシンアミド、ナイアシン、NAD⁺）とその代謝経路を追跡。次に、構造生物学およびタンパク質工学のアプローチを用いて主要酵素を調査し、断片化された研究成果を統合してNMN生合成の包括的ネットワークを構築しました。
これにより、代謝の調節機構や経路間の相互作用が明らかになりました。また、比較解析を通じて最も有望な生合成経路とその応用の展望も論じています。さらに本レビューは、NMNの産業応用に対して独自の視点を提供します。
はじめに
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）の前駆体であり、自然界に存在するモノヌクレオチド化合物の一つとして認識されています。マウスモデルではその顕著な抗老化効果が確認されており、注目が集まっています。
加齢に伴うNAD⁺の減少は、老化関連疾患の主要な病因メカニズムの一つとされています。最近の研究によれば、eNAMPTによって合成されたNMNは細胞内でNAD⁺へ変換され、高齢マウスの残存寿命を最大2.3倍まで延長する可能性があると報告されています。
NMNは、以下のような多様な疾患に対する有効性を示しています：
心血管疾患：血管の老化や虚血性障害への改善
代謝疾患：糖尿病や肥満
神経疾患：アルツハイマー病 、パーキンソン病、脳出血
老化関連疾患：骨粗しょう症、慢性炎症、加齢による色素沈着変化
加えて、NMNは次のような作用も報告されています：
卵母細胞の質の向上
腫瘍増殖の抑制
眼疾患に対する治療効果
しかしながら、過剰なNMNの蓄積は、肝臓への負荷、がん細胞の増殖促進、軸索変性などの副作用を引き起こす可能性も指摘されています。
🌿 NMN応用の広がり
近年、NMN関連製品は以下のような多岐にわたる分野で応用が進んでいます：
医療応用：NMNを含有した新規ハイドロゲル材料は、創傷治癒や骨再生におけるターゲット治療と持続放出機能を発揮します。
経皮吸収技術：マイクロニードルと組み合わせることで、皮膚を通じてNAD⁺を効果的に供給でき、抗老化・代謝改善に資する製品が開発されています。
栄養補助食品：レスベラトロール、グルタチオン等と配合することで、抗老化効果を相乗的に高めた製品もあります。
スキンケア製品：リポソームやナノスフェアによるカプセル化で浸透性が向上し、しわ改善や皮膚修復製品への応用が進んでいます。
NAD⁺と比べても、NMNの方が経済的に有利とされており、その合成技術の発展は今後の大きな経済的・産業的価値を持つと考えられます。
NMNのナイアシンアミド（NAM）からの生合成
2.1 NAMを原料としたNMN生合成の進展
ナイアシンアミド（NAM）からNMNを合成するバイオ触媒経路は、PreissとHandlerによって初めて提案されました。この経路では、NAMPT酵素が1分子のNAMと1分子のPRPP（5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸）を基質として反応させ、1分子のNMNと1分子のピロリン酸を生成します。
また、ナイアシンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（NNMT）の活性を阻害することで、体内のNAM濃度を高めることができます。実際、GYZ-319や環状ペプチド、化合物17uといったNNMT阻害剤が開発されており、NAM供給の理論的根拠を与えています。
2.2 多酵素カスケード反応による合成戦略
高収率でNMNを得るために、多酵素カスケード反応がよく用いられます。この手法には以下の利点があります：
高生分解性
高選択性
複数工程を一括処理できる効率性
廃棄物の削減
例えば、PRPPとNAMPTをアミノ型樹脂キャリアでグルタルアルデヒド架橋して固定化し、同時反応を行う手法や、**エポキシ型樹脂（LX3000）**を用いた同時固定化も実施されています。また、シリカ、磁鉄鉱、活性炭などの新規材料による固定化や、CNTsや磁性メソポーラスシリカ複合体などを用いた材料も導入されつつあります。
2.3. NAMからのNMN生合成における鍵酵素：NAMPTとPRSの構造とタンパク質工学
2.3.1 NAMPT酵素の構造とタンパク質工学
NAMPT（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）は、491個のアミノ酸から成り、分子量約52 kDaの酵素で、一般に対称型ホモ二量体として機能し、二量体の両端に2つの活性部位を形成します。この酵素はⅡ型ホスホリボシルトランスフェラーゼとして分類されており、その結晶構造から、基質（NAMとPRPP）との相互作用の詳細が明らかになっています。
特徴的なのは、Asp219とNAMのアミド基との水素結合で、これによりNAMを特異的に認識します。His247は触媒反応の中心的役割を担っており、Asp313とAsp279という2つの保存されたアスパラギン酸残基が、His247に負電荷を与えてリン酸化を促進します。PRPPのピロリン酸結合が切断され、活性中間体が生成され、これがNAMのNMNへの変換を助けます。
2.3 PRPPの生合成とその研究進展
PRPPは、NAM経路を通じたNMN合成の重要な前駆体です。研究では、糖やヌクレオチドなどの安価かつ入手容易な原料からPRPPを合成する多くの戦略が提案されています。
2.2.1 糖類を原料としたPRPP合成
D-リボースやリボース-5-リン酸（R5P）からPRPPを合成するには、次の酵素群が関与します：
NAMPT
PRS（ホスホリボシルピロリン酸合成酵素）
リボキナーゼ（RK）
ポリリン酸キナーゼ（PPK）
ある研究では、Meiothermus ruber由来の変異NAMPTと外因性のPRSおよびRKを組み合わせ、100%の変換率でNMNが合成されました。さらに、グルコースを基質としたPRPP生成では、ペントースリン酸経路（PP経路）を活性化するために関連遺伝子の発現制御も行われています。最新の研究では、キシローストランスポーター（XlyFGH）を導入し、グルコースとの併用によりNMN収率が2倍近くに向上しました。
アデノシン、AMP、IMP、GMPなどがPRPP合成に用いられる例もあります。例えば、AMPをコアとした2つの多酵素系により、19.67 g/LのNMNが得られました。しかし、ヌクレオチド基質はコストが高いため、大規模生産には制限があります。
2.2.3 その他のPRPP供給戦略
ある研究では、大腸菌においてzwfやgndの発現を促進してPP経路を活性化し、NADPHを増加させることが報告されています。ただし、NMNの収率自体は大きく向上しなかったため、補酵素のバランス調整が今後の課題です。
2.3.2 PRS酵素の構造とタンパク質工学
PRS（ホスホリボシルピロリン酸合成酵素）は、多くの生物に存在し、ATPとリボース-5-リン酸（R5P）からPRPPを合成します。この酵素は3つのクラスに分類されますが、最近の研究では主にⅠ型PRSが注目されています。
Bacillus subtilis由来のPRSの結晶構造では、Tyr97〜Thr113の可動ループ構造が重要で、ここには触媒活性に重要なArg101やHis135などが含まれています。Bacillus amyloliquefaciens由来のPRSにL135I変異を導入し、NAMPTと組み合わせることでフィードバック阻害を回避してPRPP生成量を増加。
3. NR（ニコチンアミドリボシド）からのNMN生合成
3.1 NRからのNMN生合成の進展
ニコチンアミドリボシド（NR）からニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）への酵素変換は、2004年に初めて報告されました。この反応は、NRキナーゼ（NRK）酵素によって触媒されます。
NRは、直接的な基質として使用できるだけでなく、糖配糖体化合物を出発原料とした一連の酵素反応を通じて合成されることもあります。その結果、NRからのNMN生合成には大きく4つの経路があるとされます。
3.2 NRK酵素の構造とタンパク質工学
NRKはヌクレオシドモノリン酸キナーゼスーパーファミリーに属する酵素で、NMNの合成において極めて重要な役割を果たします。
4. NA（ナイアシン）からのNMN生合成
4.1 ナイアシン（NA）からのNMN生合成の進展
ナイアシン（NA）からニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）を合成する経路では、ニコチン酸モノヌクレオチド（NaMN）が主要な中間体として関与します。この経路におけるNMN合成の鍵酵素は、NadE（NMNシンターゼ）です。
Heuserらは、E. coli においてpncBおよびnadEの発現によって細胞内のNAD⁺レベルを大幅に上昇させることに成功しました。その後、Francisella tularensis由来のNadE酵素をスクリーニングすることで、NaMNからNMNへのアミノ化反応を促進する研究が進展しました。
Blackらの研究では、Ft. NadEを過剰発現させ、さらにpncCとnadR遺伝子をノックアウトすることで、E. coli におけるNMNの細胞内濃度が1000倍に増加したと報告されています。また、Lactococcus lactis NZ9000株においてFt. NadEを異種発現させ、nadR遺伝子をCRISPR/Cas9で破壊することにより、NMNの蓄積量が61%増加しました。これは、他種由来のNadEの導入が発酵生産で効果的であることを示しています。今後の課題としては、経路内の酵素を広範にスクリーニングし、それぞれに適した発現系の構築や、NMN代謝経路の改変戦略の確立が求められます。
4.2 NadEおよびNaPRTの構造とタンパク質工学
🧬 NaPRT（ナイアシン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ）
NaPRTは、ナイアシン（NA）とPRPPからNaMNとピロリン酸を生成する反応を触媒します。
NAD⁺合成のPreiss–Handler経路の第3段階において、律速酵素として機能します。ヒト由来NaPRTは、分子量58 kDaで、ゲルろ過後には二量体構造をとることが示されています。
🔍 活性に関与する残基
R318、Y21、H213：これらの変異により触媒活性が低下 → 重要な触媒部位
R171、K396、S214：基質認識に関与
特にR318は酵素の触媒反応の主因子であるとされています
🧪 NadE（ナイアシン酸モノヌクレオチドアミダーゼ）
Francisella novicida U112株由来のFt. NadE酵素の結晶構造が明らかにされており、ホモ二量体として存在します。NadEは、NaMNからNMNへのアミノ化反応を触媒しますが、この反応にはアンモニア（NH₃）が必要です。
5. NAD⁺からのNMN生合成
5.1 NAD⁺からのNMN生合成の進展
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）からニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）を合成するこの経路では、NADピロホスファターゼ（NADPP）という酵素が中心的な役割を果たします。この酵素は、NAD⁺を加水分解してNMNとAMPを生成します 。
NADPPは、ヌクレオシド二リン酸加水分解酵素ファミリーに属し、NAD⁺のピロリン酸結合を特異的に切断します。植物・動物・微生物細胞など幅広い生物に存在する酵素です。実際、この経路は最も初期に開発されたNMN合成法の一つとされています。
<h4 class="title-m mt-40">5.2 NADPP（NADピロホスファターゼ）の構造と酵素工学</h4>
Höferらの研究により、大腸菌由来NADPP（別名：NudC）の結晶構造が明らかになりました。以下のような特性が判明しています：
NADとNMNとの複合体を形成するホモ二量体
Trp194 はNAD⁺とNMNの両方と相互作用を示す残基であり、NAD⁺との結合時は、ニコチンアミド基とスタッキング
NMNとの結合時は、リボース環と相互作用
W194A変異体は不活性化 → Trp194の重要性を裏付け
Arg69 は、NMN生成後の構造再配列を誘導"
6. NMN生合成におけるATPの調節
ATPの重要性と供給戦略
ATP（アデノシン三リン酸）は、多くの代謝経路において駆動力として不可欠な分子です。NMNの生合成においても、PRPPの合成やNAMPT反応をはじめ、さまざまな反応でATPが消費されます。このため、ATP供給を最適化することは、NMN生産の効率向上に直結します。以下のような調節戦略が採用されています：
代謝工学によるエネルギー代謝の改変
ATP再生酵素の共発現（たとえばピルビン酸キナーゼやホスホグリセリン酸キナーゼ）
ATP再生の実例と効果
NAMPTはATPの加水分解によってリン酸化され、その活性が誘導されますが、同時にADPが副生成物として蓄積します。これは以下の問題を引き起こします：
ADPはRPPK（リボースリン酸ピロホスホリラーゼ）のアロステリック阻害因子となり、全体の触媒効率を低下させる
NAMPT酵素を過剰添加しても、ADP蓄積によりNMNの収率は逆に減少することが確認されています
NR→NMN反応におけるATP再生
NRを基質としてNMNを合成する過程では、NRKとアセテートキナーゼ（ACK）を同時発現させることで、極めて高効率なATP再生が実現されています。
ACKの比活性：1876 U/mg
ATPのリサイクル回数：144.8回
→ NRからNMNへの変換を支えるATP供給機構として極めて有望
間接的なATP調節戦略
ATPを直接再生するだけでなく、以下の方法で間接的にATP濃度を調整することも可能です：
NAMPT反応で生じるPPi（無機ピロリン酸）**がATP加水分解を促進し、NAMPT活性を高める
ADP・AMPなどの副生成物がATPレベルに影響を与える
AMPプールの調整には、amn、ado1、add遺伝子を操作する「サルベージ経路」が有効
ある研究では：
E. coli にado1遺伝子を導入し、amnをノックアウト
その結果、細胞内ATP濃度が有意に増加
<h4 class="title-m mt-40">CRISPRiによるATP消費制御の可能性</h4>
近年、CRISPR干渉（CRISPRi）技術が生合成分野で注目を集めています。この技術は、ATPやNADPHを大量消費する非必須酵素遺伝子を標的に抑制することができ、以下のような成果が報告されています：
Shenらは、E. coli においてNADPH・ATP消費遺伝子を選択的に抑制
目的産物（4-ヒドロキシフェニル酢酸）の収率が向上し、菌の成長にも影響なし
