元論文：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405805X25000523
要旨
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は、肉類・果物・野菜など多くの食品に豊富に含まれている、生物学的に重要なヌクレオチドです。近年、老化を遅延させる可能性があることから大きな注目を集めています。
現在では化学合成による生産法が一般的に用いられていますが、これらの方法は環境に優しい「グリーン生産」の基準を満たしていません。一方で、NMNの生物合成（バイオ合成）は、安全性が高く、環境持続可能性にも優れていることから、より望ましい選択肢とされています。
本研究では、NMNのバイオ合成研究を包括的に分析するため、「基質-経路-酵素学（substrate-pathway-enzymology）」という新たな枠組みを構築しました。
まず、以下の4つの基質（ニコチンアミドリボース、ニコチンアミド、ナイアシン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の代謝ルートを体系的に追跡しました。
次に、構造生物学およびタンパク質工学の手法を用いて、主要酵素の詳細な解析を行い、これまで断片的だった研究成果を統合することで、NMN合成ネットワーク全体を構築し、複雑な代謝制御や経路の相互作用を明らかにしました。
最後に、比較分析により最も有望なバイオ合成経路とその展望を議論するとともに、本レビューはNMNの産業的応用に向けた新たな視点を提供しています。
1. はじめに
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）の前駆体であり、自然界に存在するモノヌクレオチド化合物です。マウスなどのげっ歯類モデルにおいて、顕著な抗老化効果が確認されており、その生物学的意義は高く評価されています。
加齢に伴ってNAD⁺の体内レベルが低下することは、加齢関連疾患の主な病因メカニズムのひとつとされています [3]。近年の研究では、eNAMPTにより合成されたNMNが細胞内でNAD⁺に変換されることで、老齢マウスの残存寿命を最大2.3倍延長できることが示されました。
NMNはまた、血管老化や虚血性損傷のような心血管疾患の改善に効果を示すだけでなく、糖尿病や肥満といった代謝疾患にも有望です。
さらに、NMNはアルツハイマー病、パーキンソン病]、脳出血などの神経疾患に対しても治療的効果を持つ可能性があります。その他にも、骨粗鬆症、慢性炎症、加齢に伴う色素変化など、老化関連の合併症を緩和することが報告されています。
最近の研究では、NMNが卵母細胞の質を改善し、腫瘍の増殖を抑制し、さらには眼科疾患にも治療的効果を示す可能性があることが明らかにされています。一方で、NMNの過剰蓄積は副作用を引き起こす可能性もあり、肝臓への負荷、がんの進行、軸索変性などが指摘されています。
現在、NMN関連製品は様々な分野で活用されており、特にバイオメディカル分野では、NMNとハイドロゲル素材の組み合わせにより創傷治癒や骨再生のターゲット治療が可能となっています。また、マイクロニードル技術と組み合わせることで、皮膚を通じたNAD⁺の効率的な送達と調節が可能となり、アンチエイジングや代謝疾患向けの新たな治療製品としての応用が期待されています。
NMNは、レスベラトロールやグルタチオンなどの成分と併用されることも多く、その相乗的な抗老化効果を高めるサプリメント製品も登場しています。さらに、リポソームやナノスフィアによる皮膚送達の改良により、シワ改善や皮膚修復を目的としたスキンケア製品としての活用も進められています。NAD⁺に比べてコストパフォーマンスに優れるとされるNMNは、今後ますます需要が高まると予測され、その合成法の高度化は大きな経済的・発展的価値を有します。
NMNの合成法は大きく分けて「化学合成」と「生物合成（バイオ合成）」の2つに分類されます。Tanimoriらが開発した化学合成経路をMigaudが改良した手法では、エチルニコチネートとテトラアセチルリボースを前駆体とし、TMSOTfによる縮合、脱アセチル化、リン酸化、アンモニア処理といった工程を経てNMNが得られます。
しかし、化学合成は有機溶媒を多用するため、環境に配慮した「グリーンプロダクション」の要件を満たさないのが実情です。
その一方で、生物合成は安全性・効率性・環境適合性に優れており、より有望な市場性を持ちます。このため、NMNの生物合成に関する研究開発が活発化しています。
生物合成の主要手法のひとつである酵素触媒法は、以下の4つの経路に分類できます：
ニコチンアミド（NAM）経路
ニコチンアミドリボース（NR）経路
ナイアシン（NA）経路
NAD⁺経路
本レビューでは、「基質—経路—酵素学」という枠組みに基づいて、4つの基質（NAM, NR, NA, NAD⁺）とそれぞれの代謝経路を追跡し、構造生物学とタンパク質工学の視点から重要酵素を考察します。
さらに、NMN生合成ネットワークを体系的に構築し、最も有望な経路とその産業的可能性についても議論します。
2. NMNのニコチンアミド（NAM）からの生合成
2.1 NMNのNAMからの生合成の進展
NMNをニコチンアミド（NAM）から生合成する生触媒経路は、PreissとHandlerによって初めて提案されました。この経路では、NAMPT（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）がNAMとPRPP（5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸）を基質として、NMNとピロリン酸（PPi）を生成します。
2. NMNのニコチンアミド（NAM）からの生合成
また、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（NNMT）の活性を抑制することで、NAMの細胞内濃度を増加させることも可能です 。NNMTの阻害剤としては、GYZ-319、環状ペプチド、化合物17uなどが開発されており、これらはNAMの利用可能性を高める理論的根拠を提供します。
NAMPTの酵素動態（Km、Kcatなど）は表1に示されており、Haemophilus ducreyi、Bacillus velezensis、Meiothermus ruber、Chitinophaga pinensis、Arcobacter属のファージKVP40、Francisella tularensis、Vibrio nigripulchritudoといった多様な種からスクリーニングが行われています。
この中でも、KVP40由来のNAMPTは高い特異活性を示し、たとえばHd-NAMPTはPRPPに対して (481.67±11.67) mM⁻¹s⁻¹のKcat/Km、Mr-NAMPTはNAMに対して (3.60±0.14)×10³ mM⁻¹s⁻¹ のKcat/Kmを示します。これは、種によって基質親和性や触媒効率が大きく異なることを意味しています。
マルチ酵素カスケード反応の利用
高収率でNMNを得るために、マルチ酵素カスケード反応（多酵素同時反応）がよく採用されています。この方法は、高選択性・生分解性・生体適合性に優れ、効率的なNMN生合成が可能です 。
この手法では、精製ステップを大幅に省略できるため、生産効率が向上し、廃棄物も削減されます。
また、複数の酵素を同時に固定化することで、触媒性能のさらなる向上も報告されています。
たとえば、PRPPとNAMPTはグルタルアルデヒドで架橋され、アミノ系樹脂担体に固定化されました。
NAMPTとPRPP合成酵素（PRS）は、エポキシ型樹脂（LX3000）を用いて同時固定化されています 。変異型のPRSとNAMPTは、ミクロスフェアや樹脂により固定化されています。
他にも、シリカ、磁性ナノ粒子、活性炭などの担体も利用されています。
さらに、ポリアクリル酸、ポーラスカーボンナノチューブ（CNTs）、メソポーラス磁性シリカ微粒子（mSiO₂@SiO₂@Fe₃O₄）などの新素材も応用されています。これらの固定化酵素はリサイクルや再利用が可能であり、工業規模での応用性向上に貢献しています。
2.2 PRPPの前駆体としての合成および研究の進展
PRPP（5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸）は、ニコチンアミド（NAM）経路によるNMN合成に不可欠な中間体です [80]。しかし、PRPPの供給はコストや生産性の面で課題が多いため、安価で入手しやすい基質（糖やヌクレオチド）を用いた合成戦略が提案されています。
以下では、PRPPの合成に関する3つの主要なアプローチを紹介します。
2.2.1 糖類を出発物質とするPRPP合成
糖類を用いる場合、リボースやリボース-5-リン酸（R5P）、NAM、ポリリン酸など複数の基質と酵素が必要となるカスケード反応となります。たとえば、以下の酵素群が関与します：
NAMPT（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）
PRS（PRPP合成酵素）
リボキナーゼ
ポリリン酸キナーゼ（PPK）
Meiothermus ruber DSM1279由来の変異NAMPTを用い、外部から追加したPRSおよびリボキナーゼを併用することで、リボース＋NAM＋ATPから100%の変換率でNMNを得ることに成功しました 。
2.2.1 糖類を出発物質とするPRPP合成
また、R5P＋ATP＋NAMを用い、PRSおよびNAMPTを含む固定化細胞を使うことで、13.3 g/LのNMNを得た報告もあります。
現在の研究の多くでは、グルコースを出発物質とし、ペントースリン酸経路（PP経路）を介してPRPPを合成し、経路に関わる遺伝子の制御が試みられています。
最新の研究では、キシローストランスポーター「XlyFGH」を過剰発現させ、グルコース＋キシロースの二重炭素源を共培養することで、単一炭素源よりもNMN収率を2倍に向上させています 。
輸送体に関しても、以下が有望とされています：
NiaP（NAM輸送体）：Burkholderia cenocepacia由来
PnuC（NMN輸送体）：Bacillus megaterium由来
また、哺乳類においてはSlc12a8というNMN専用トランスポーターが存在し、NAD+の消費に応じてそのmRNA発現が増加することが知られています。
これらの知見は、トランスポーターの特定・評価・応用の重要性を裏付けています。
さらに、スターチ（でんぷん）＋NAMのような再生可能かつ安価な原料を用いた8種類の酵素によるワンステップNMN生合成法も提案されており、低コスト・高品質な産業応用が期待されています。
2.2.2 ヌクレオチドを出発物質とするPRPP合成
PRPP合成に利用される主なヌクレオチドは以下の通りです：
アデノシン
AMP（アデノシン一リン酸）
IMP（イノシン一リン酸）
GMP（グアノシン一リン酸）
ある研究では、アデノシン＋NAMを基質とし、アデノシンキナーゼ＋ヌクレオチドトランスフェラーゼ＋NAMPTで19.67 g/LのNMNを合成した例があります。
AMPを基質とする場合には、以下の2つのマルチ酵素系が使われました：
AMPase＋PRPP合成酵素＋NAMPT
アデニンヌクレオチドトランスフェラーゼ＋NAMPT
また、IMPを用いた例では、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ＋NAMPT＋キサンチンオキシダーゼによりNMNを粗製造しています。IMP＋ATP＋NAMを用いたワンポット合成法もあります。
しかし、AMPやIMP、GMPといった原料はアデノシンより高価であるため、大規模生産における実用性は低いとされています。
2.2.3 その他のPRPP供給戦略
ある研究では、Escherichia coli（大腸菌）変異株においてzwfおよびgndの発現を強化することで、PP経路を活性化させました。
その結果：
PP経路およびEntner-Doudoroff経路が著しく促進
EMP経路（解糖系）が抑制
G6P（グルコース-6-リン酸）からの炭素流束が増加
NADPHの蓄積量も増大
また、zwfとgndを共発現することで、細胞成長に悪影響を与えることなく、PPおよびED経路への炭素流束を向上させました。
さらに、内在性7遺伝子（zwf, pgi, pgl, gnd, prs, rpiA, rpiB）を大腸菌に発現させることで、グルコースからPRPPへの変換が成功しています。
しかし、zwfとgndの発現増強にもかかわらず、NMNの収率は大きく増加しなかったとの報告があります。これは、補酵素のバランスの変化が収率に影響する可能性を示唆しています。
今後は、経路における調節機構の解明や、重要因子の抑制制御に焦点を当てた研究が期待されます。
2.3 NMN合成における主要酵素：構造とタンパク質工学
2.3.1 NAMPTとPRSの構造およびタンパク質工学
NAMPT（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）は、491個のアミノ酸からなる分子量約52kDaの酵素であり、通常は対称的なホモ二量体として機能し、それぞれの端に活性部位を持ちます。
結晶構造解析により、NAMPTがタイプIIのホスホリボシルトランスフェラーゼとして作用することが確認されています。また、マウス由来NAMPTとその生成物NMNとの複合体構造が明らかになり、基質との相互作用のメカニズムが理解されつつあります。
特徴的なのは、Asp219とアミド基との水素結合であり、これがNAMを特異的基質として識別する決定因子となります。
His247は酵素活性に極めて重要であり、Asp313やAsp279といった保存性の高いアスパラギン酸残基がHis247をリン酸化状態に保つことで、PRPPのピロリン酸結合を切断し、正に帯電した中間体を形成し、最終的にNMN生成へとつなげます。
また、ヒトNAMPT（Homo sapiens由来）をモデルとした研究では、His247やAsp313といった保存されたアミノ酸残基の重要性が改めて強調されており、結合ポケットと触媒効率の鍵であることが示されています。
最近の研究では、His247がリン酸化された状態（pHis247）であれば、ナイアシン酸（NA）がNAMの代替基質となることが明らかにされました。
pHis247はPRPPの位置を最適化・安定化し、触媒反応の効率を高める効果があります。
また、Xanthomonas campestris由来NAMPT（Xcc-NAMPT）とNMNとの複合体構造も解析され、その酵素活性はヒトNAMPTよりも高いと報告されています。
NMNのリボース-リン酸部分がArg373と水素結合し、Asp12, Phe177, Arg180, Arg293, Gly364 とのvan der Waals相互作用を増やしていることが特徴です。
Asp355およびリン酸化His229も反応促進に寄与することが確認され、H229A変異体も作成されました。
M. ruber DSM1279やLuteibacter sp.由来のNAMPTを用い、部位特異的変異（E231Q/D298A/D338E/D337EやR189H/S232T/R392K）を導入した結果、それぞれ6.9倍および9.5倍の特異活性が得られました。
他にも、314, 315, 417, 419, 450, 452番目のアミノ酸に変異を加えることで、5.3倍の活性向上を実現した例があります。
また、Y15Sの単一変異は、耐熱性（半減期が150.15時間に延長）とPRPPに対する触媒効率（kcat/Km 1.92倍向上）を改善することが確認されています。
しかし、この変異だけでは、高濃度基質条件での基質チャネルのボトルネックは解消できませんでした。
そこで、Y13G/F76Pとのチャネル拡張型の変異と組み合わせたデュアルチャネル設計が導入され、kcat/Kmを3.95倍に向上、PRPPとの結合安定性を保持しながら、変換率99.8%（19.94 g/L）を達成しました。
さらに、Hd-NadV（Haemophilus ducreyi由来のNAM変換酵素）に関する構造解析も進行しており、活性部位とアロステリック部位の2箇所にNAMが結合することがわかっています。
保存されたアミノ酸残基D222およびR311が基質特異性を決定し、アロステリック部位にあるH194/I363の疎水性ポケットが立体構造の変化を通じて触媒効率を高める可能性が示唆されています。
PRSは広範な生物に分布し、ATPとリボース-5-リン酸（R5P）からPRPPを生成します。PRSファミリーは主に3つの型に分類され、最近はType I PRSが研究の中心です。
Bacillus subtilis由来PRS1の結晶構造解析では、Tyr97〜Thr113の間に柔軟なループがあり、反応時に構造変化を起こすことで触媒反応に関与することが示されています。このループ内のArg101およびHis135は重要な保存残基です。
Marinescuらは、Bacillus amyloliquefaciens由来のPRSにL135I変異を導入し、PRPP合成酵素のフィードバック阻害を解除することで、PRPPの生成量を向上させ、E. coliでのNMN合成に成功しました。
さらに、PRSとNAMPTの同時変異（例：PRS-H150Q＋NAMPT-Y15S）により、NMN濃度8.1 g/Lを達成した研究もあります。
PRS-H150QはATPに対するkcat/Kmが3.26倍に上昇し、R5Pを基質とした際のKm値は20.8%低下、副生成物（ATP, ADP, PPi, AMP）との相互作用も弱まりました。
これらの結果は、NAM経路における主要酵素のタンパク質工学的最適化の可能性を示しています。
3. NR（ニコチンアミドリボシド）からのNMN合成
3.1 NRからのNMN合成における進展
ニコチンアミドリボシドキナーゼ（NRK）によってNRがNMNへと酵素変換される経路は、2004年に初めて報告されました。NRは基質として利用されるだけでなく、一連の酵素反応によってグリコシド化合物から合成することも可能です。
そのため、NRからNMNを合成する経路は大まかに4種類に分類されます。
近年、NRKに関する研究は、異種発現や種のスクリーニングに焦点が当てられています：
Thermothielavioides terrestris NRRL 8126、ヒト（Homo sapiens）、Kluyveromyces marxianus 、Saccharomyces cerevisiaeなどが成功裏に発現されています。
NRKの動態パラメータ（Table 2）によれば：
Sc-NRK1の特異活性は7.9 U/mg、Klm-NRKの特異活性は2252.59 U/mgと非常に高いです。Klm-NRKとHomo-NRK2は、NRとATPに対して良好な結合親和性と触媒効率を示しています。
また、NRを必須とする補因子欠損型酵母を用いたバイオアッセイ系により、NMNやNRを生成できる菌株の分離にも成功しています。ただし、自然発現による産生量は低く、産業的応用には限界があります。
NRKの酵素活性と安定性を高めるため、さまざまな固定化手法が試されています：
S. cerevisiae由来NRKをBL21で可溶性タンパク質として発現させ、6-HISタグを用いて固定化することで安定性を向上。
S. cerevisiaeにおけるフロクキュリン（凝集因子）システムを用いて細胞表面工学にも応用されています。
さらに、Aga2pとの融合によりHomo-NRK2を酵母表面に効率的に提示する技術も開発されています。
この酵母表面提示工学（yeast surface display）は成熟した技術であり、精製や固定化を必要とせずに操作が簡略化されます。
今後は、従来の酵素固定化技術と酵母表面提示システムを統合することで、NRK研究の新たな展望が期待されます。
コスト削減を目的に、NRの代替合成経路も開発されています：
D-リボース、NAM、ATPを基質として、リボキナーゼ・ペントースリン酸変換酵素・NRKの3酵素カスケード反応によりNMN合成が成功しました。
E. coli K12において発見された変異型ウリジンホスファターゼは、NAMとリボース-1-リン酸からNRを合成可能です。
アデノシンを基質として、Bos taurus由来プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、Haemophilus influenzae ATCC14592由来NRK、およびPPKを用いた反応では、75.15 g/Lという高収率でNMNが得られました。
ウリジンを基質としたNR合成法も研究されており、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、NRK、PPK2の酵素カスケードで実現されています。
また、NRの細胞内取り込みを促進する膜輸送体pnuCの有効性も示されており、全細胞系におけるNRからNMNへの合成経路として非常に有望です。
近年の研究により、NMNがCD73依存性経路で細胞外でNRに変換される可能性が指摘されています。
この経路の存在は、NMNとNRの相互変換メカニズムの理解に新たな視点を与えます。
また、HPLC法の最適化も行われており、この経路の製品分析にも有用な指標が得られています 。
3.2 NRK（ニコチンアミドリボシドキナーゼ）の構造とタンパク質工学
NRKは、ヌクレオシドモノフォスフェートキナーゼスーパーファミリーに属し、NMN合成において中心的な役割を果たします。
🔬 構造と反応機構の解明
過去の研究では、NRK1の結晶構造および分子機構が調査されており、とくに触媒過程および関連生成物との関係性に重点が置かれてきました。
NRK1では、Asp56およびArg129がNRのリボース水酸基を認識するのに重要。
Arg128およびArg132はATP結合部位として機能。
また、Asp36、Asp56、Lys16が活性部位候補として特定されています。
🔧 タンパク質工学による活性向上の試み
NRKの触媒活性を高めるため、変異導入やタンパク質工学的手法が積極的に行われています。
K. marxianus由来NRK変異体に4点変異（D45E/D58Q/R161K/Y164W）を導入した結果、野生型と比べて活性が6.4倍に向上。
ヒトNRKの野生型に15か所の変異を導入し、酵素の安定性と触媒活性を同時に強化した研究もあります。
🧬 合理的設計と部位特異的変異
アミノ酸配列と立体構造の解析に基づいて、NRK1にT47VおよびN62Dの2点変異を導入。
T47V変異体の触媒活性は130%向上、触媒効率は100%増加、安定性も20%改善と報告されています。
この結果は、活性部位周辺の合理的アミノ酸変異が重要であることを示しています。
🧠 DCS法による半合理的変異設計
現在では、ドッキング組み合わせシミュレーション（DCS）に基づいた半合理的変異戦略が開発されました。
DCSを利用して得られた変異体NRK-D45T/I88R/E189Aは、酵素活性が22.95 U/mg（1.9倍向上）、安定性と基質親和性が著しく改善。
この結果は、コンピュータネットワークによるタンパク質構造予測と仮想変異がタンパク質工学において極めて重要であり、実験の精度と効率を飛躍的に向上させることを示しています。
4. ナイアシン（NA）からのNMN生合成
4.1 NAからのNMN合成における進展
NA（ナイアシン）からNMNを合成する経路では、中間体として**NaMN（ナイアシンモノヌクレオチド）**が関与しており、NMN合成に関与する酵素はNadEです。
Heuserらは、pncBとnadEをE. coliで発現させることで、細胞内のNAD+レベルを大幅に上昇させました。
続く研究では、F. tularensis由来のNadEをスクリーニングし、NaMNのアミノ化を促進してNMNを生成させることが試みられました。
Blackらは、Ft. NadEの過剰発現およびpncCとnadR遺伝子のノックアウトによって、E. coliの細胞内NMN濃度を1000倍に増加させたと報告しています。
さらに、pncBの発現によってNaMNの合成効率を改善した事例もあります。
他の研究では、Lactococcus lactis NZ9000株においてFt. NadEを異種発現させ、さらにnadRをCRISPR/Cas9でノックアウトし、NMNの蓄積量を61%増加させました。
これらの成果は、L. lactis NZ9000への異種NadE発現の有用性を示しています。今後の研究では、この経路に関与する酵素のスクリーニングや宿主株の選定、NMN関連代謝経路の改変戦略の探究が期待されます。
4.2 NadEおよびNaPRTの構造とタンパク質工学
NaPRTは、NAとPRPPからNaMNと無機ピロリン酸（PPi）を合成する最初の酵素です。
もともとは「NaMNピロホスファターゼ」と呼ばれていました。
NaPRTはNAD+合成のPreiss–Handler経路の第3段階の律速酵素として重要です。
<h4 class="title-m mt-40">4.2 NadEおよびNaPRTの構造とタンパク質工学</h4>
Homo由来のNaPRTは、分子量約58 kDaであり、ゲルろ過後は約87,000 Daで、二量体構造を形成します。
研究により、保存性の高い残基（R318、Y21、H213）が触媒活性に不可欠であると確認されています。
結晶構造の解析では、R171、K396、S214が基質認識に関与し、R318が触媒反応の主要因であることが明らかとなっています。
Ft. Novicida U112由来のNadEがこの合成経路を触媒します。
その結晶構造も解明されており、NadEはホモダイマー構造をとることが確認されています。
この酵素はNaMNに特異的であり、NMNの生成にはアンモニア（NH₃）が必要です。
触媒活性部位には、E147、D202、K171、D41、T142、S193などの残基が関与し、Gln149は基質結合チャネルにおいて重要な役割を果たしています。
5. NAD+からのNMN生合成
5.1 NAD⁺からのNMN合成に関する進展
NAD⁺からNMNを合成する経路は、NADピロリン酸加水分解酵素（NADPP）の酵素反応に基づいており、NAD⁺を加水分解してNMNとAMPを生成します。
NADPPはヌクレオシド二リン酸加水分解酵素ファミリーに属し、NAD⁺中のピロリン酸結合を特異的に切断し、植物、動物、微生物の細胞全体に広く分布しています。
この酵素経路は、NMNを合成する最も初期の方法の1つとして報告されています。
しかしながら、NAD⁺は不安定かつ高価であることから、産業規模でのNMN生産には適していないとされています。
🔬 NAD⁺代謝に関する現在の研究動向
この経路に関する現在の研究は、主にNAD⁺の代謝分解に焦点を当てており、以下の酵素群が関与しています：
nudE, nudC [138], mazG,さらに、NAD⁺をNAMに分解する酵素群：SIRTs（サーチュイン）、PARPs（ポリADPリボースポリメラーゼ）、NAD(H)グリコシダーゼ、cADPR合成酵素 CD38など 。
🧪 酵素によるNAD⁺→NMN変換の報告
NudCやNudEなどの酵素を用いて、NAD⁺からNMNを合成した研究があります。
mazGやushAなど、NAD(P)Hの分解に関与する類似機能酵素も、高いNAD⁺加水分解活性を示します。
ushAを削除するとNAD⁺レベルが安定し、nudCおよびnudEの削除によりNAD⁺の分解経路が抑制されます。
よって、nudCおよびnudEの活性を強化することで、NAD⁺からNMNへの変換が促進され、NMNの蓄積量が増加します。
さらに、CD38、CD157といったcADPR合成酵素、PARPsやSIRTs、NAD(H)グリコヒドロラーゼなどは、NAD(H)をNAMへと分解します。
したがって、これらの関連酵素に対するタンパク質工学的研究は、NAD⁺が他の物質に変換される経路を減少させることで、NMN合成の向上に寄与する可能性があります。
5.2 NADPPの構造とタンパク質工学
Höferらは、E. coliにおける**NADピロリン酸加水分解酵素（NADPPまたはNudC）**の結晶構造を解明しました。
この研究では、NADPPがNADおよびNMNとどのように相互作用するかについての分子メカニズムが明らかにされました。
Trp194（トリプトファン194）は、基質NAD⁺および生成物NMNの両方と異なる方法で相互作用。
NAD⁺結合時はニコチンアミド部分と不完全に積層し、NMN結合時にはリボース環と結合。
W194A変異体の失活により、この残基の重要性が実証されました。
さらに、Arg69が、NAD⁺とNMNで異なる結合方向の変化を引き起こす主因であることが示されました。
これらの知見は、NADPPの触媒特性を改良するための将来的なタンパク質設計に向けた理論的基盤を提供しています。
6. NMN合成におけるATPの制御
ATP（アデノシン三リン酸）は、さまざまな代謝経路を駆動する上で中心的な役割を果たします。
NMN合成の効率を高めるためには、ATPの供給を強化する以下のような戦略が用いられています：
🔧 ATP供給戦略の概要
エネルギー基質の操作や、ATP生成に関与する酵素の融合発現（例：ピルビン酸キナーゼ, ホスホグリセリン酸キナーゼ）など。
NAMPTはATPを加水分解してリン酸化され、触媒活性が活性化される一方、副生成物としてADPが生じる。
⚠️ 酵素カップリング反応における問題点
AMPを基質とした酵素カップリング反応でNMNを合成する際、酵素比（AMPase:RPPK:NAMPT）を1:6:8から1:6:10に変更すると、NMN収率はかえって低下しました。
この現象は以下を示唆しています：
NAMPTの過剰添加 → ADPの蓄積増加
ADPはRPPKのアロステリック阻害因子であり、系全体の酵素効率を低下させる
🔁 ATP再生系の導入による改善
Sinorhizobium meliloti由来のポリリン酸キナーゼ2（PPK2）を導入することで、ADPからATPへの再生が可能になり、ADP濃度が約1.5倍減少、NMNの収率は16.7%向上しました。
また、他にも以下のPPK2酵素が高い特異活性を持つことが報告されています：
Lampropedia hyalina DSM 16112：172.3 U/mg
Sulfurovum lithotrophicum：282.9 U/mg
加えて、
Sinorhizobium meliloti 02148やDeinococcus radiodurans などもATP再生系の共発現候補として挙げられています。
🧪 ACK酵素によるATPリサイクルの成功事例
NRからNMNへの変換反応において：
NRKとアセテートキナーゼ（ACK）を同時に発現ACKは特異活性が1876 U/mgと非常に高く、システム内でATPを144.8回再利用可能ATP再生において大きな可能性を示しました。
⚙️ ATPを間接的に調整する戦略
ATPの調整は直接的な供給のほか、前駆体や代謝産物の制御によっても可能です：
PPi（ピロリン酸）：NAMPTの反応副産物であり、ATP加水分解を促進し、NAMPTの触媒効率向上に寄与。
ADPやAMP：ATPレベルのバランスに影響。
🧬 AMPプールの制御とATP強化
AMPを変換するサルベージ経路（amn, ado1, add遺伝子）を操作することで、ATP間接制御が可能です。
ある研究では、E. coliにado1を統合し、amnをノックアウトした結果、細胞内ATPレベルが大幅に上昇。
🧪 ホストのATPレベル最適化戦略：CRISPRiの活用
CRISPR干渉（CRISPRi）技術を使って、NADPHやATPを消費する酵素の発現を抑制することで、ターゲット物質（例：4-ヒドロキシフェニル酢酸）の生産量が増加。
Bacillus subtilisにおけるcrRNA迅速組立法（SOMACA）の導入で、CRISPRi編集効率が向上し、ATP制御における有用性が高まっています。
💡 今後の展望
CRISPRiを用いたATP調整戦略は、NRおよびNAM経路におけるNMN生産の強化において、有望な方向性と考えられています。
7. 今後の展望（Future and Prospects）
7.1. 有望な合成経路の展望
NMNの産業的生産ニーズに応えるため、研究者たちは「単純・高効率・低コスト」なバイオ合成法の探究を続けています。
本レビューでは、NMNの4つの主要な合成経路の長所と短所を分析し、これまでに得られた研究成果を比較・統合しています。
特に、
ナイアシン（NA）やNAD⁺からの経路は研究が少なく、収率も低め。
一方、ニコチンアミド（NAM）経路は広く研究されており、NAMと炭素源を基質とした「ワンポット・多酵素反応」により高収率が可能です。
しかし、複数の酵素が関与するため、NMNの精製工程が複雑になるという欠点もあります。
対照的に、NR経路（ニコチンアミドリボシド→NMN）は：
1段階の反応
単一酵素（NRK）
低コストな基質
これらの特徴により、研究はまだ限定的ですが収率が高く、産業応用のポテンシャルが大きいと考えられます。
🚧 現在のNR→NMN変換の課題
特許で示される複雑な多酵素系への過度な依存
単一酵素（NRK）経路の未開拓
シャーシ株の多様性不足
ATP供給問題
<h3 class="title-m mt-40">7. 今後の展望（Future and Prospects）</h3>
🔬 5つの戦略的研究方向
酵素スクリーニング：NRKの有望種を探索し、NRK遺伝子プールを拡大
タンパク質工学：AI・機械学習を活用してNRKの設計・変異導入を効率化
コスト最適化：NRやATPを自家合成できる株を探索し、培地コストを削減
ATP最適化：ATP再生酵素の高活性株をスクリーニング
新規シャーシ株探索：より多様な微生物属での実用化を試み、データベースを充実
これらの取り組みは、NRからNMNへの効率的かつスケーラブルな合成プロセスの実現につながり、将来的な工業化を推進します。
本レビューでは、NMNのバイオ合成に関して、「主要基質→前駆体追跡→研究進捗→鍵酵素分析」という枠組みで整理しています。
主なポイントは以下の通りです：
基質利用に基づく前駆体（NAM, NR, NA, NAD⁺）の代謝的特徴と応用
主要酵素（NAMPT, PRS, NRK, NaPRT, NADPP）の触媒機構と工学的改良
ATP再生など、宿主代謝ネットワークの最適化事例の紹介
💥 産業スケールでの課題
経路競合や代謝負荷による合成効率の限界
高コストな前駆体への依存
エンドトキシン残留による食品グレード応用のリスク
💡 複合戦略の統合での解決法
複数経路の同時活性化
共基質活用戦略
代謝工学との融合
例：
E. coliにNAM・アスパラギン酸・NA・PRPPを同時供給 → Preiss-Handler経路＋サルベージ経路＋de novo経路の同時活性化
Pichia pastorisにエタノール・グルコース・NAMを供給 → de novo + サルベージ経路の同時活性化
キシロース・グルコースの共利用 → NRK経路最適化と連動
🔗 代謝相互作用による革新技術
酵母＋大腸菌の共培養システム → ATPを共有し、NMN産生量が2.7倍向上
機械学習×クオラムセンシングによる補酵素動態制御（QS-ML） → NADPH/NADHバランスを動的に最適化し、高密度発酵でも安定性を維持
🧫 宿主の選択と食品応用の課題
現在の主流：E. coli
ただしエンドトキシンが食品・医薬用途に課題
酵母（GRAS指定）も検討されているが、培養時間が長い・分泌効率が低いなどの課題
一方、Bacillus subtilisはすでに食品用途で使用実績があり、安全なシャーシ株として注目されている
🤖 酵素プロトタイピングの革新：計算×実験の融合
半合理的設計（DCS戦略）：
分子ドッキング（AutoDock Vina）
構造誘導変異（Rosetta Design）
分子動力学（GROMACS）
AI予測（AlphaFold）→ 75%の高効率変異達成
CaverDockで酵素チャネルのエネルギー障壁を解析
CpNAMPT-Y13G/F76P変異によりチャネル断面積が38%拡大し、触媒効率が2.3倍、PPi耐性が29.4%向上
🔮 今後の最重要戦略
「動的構造解析」+「AIによる知的設計」+「自動検証プラットフォーム」
シミュレーション → 構造最適化
AI → 高精度な変異設計
マイクロ流体などでの自動スクリーニング
🔚 結論
これらの統合戦略により、高品質な日常用NMNサプリメントの開発が可能となり、人類の健康に貢献する可能性が高まっています。
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