元論文：https://www.mdpi.com/1424-8247/18/3/281
抄録
背景：ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）およびニコチンアミドリボシド（NR）は、NAD⁺代謝における中間生成物である。これらのサプリメントは組織内のNAD⁺レベルを上昇させ、加齢や肥満に関連する健康問題に対処する可能性がある。しかし、NMNおよびNRが動脈硬化に与える影響については未だに明確に解明されていない。
方法：C57BL/6JマウスおよびアポリポプロテインEノックアウト（ApoE−/−）マウスを用いて、NMNおよびNRの補給が血清脂質、脂肪肝、そして動脈硬化に与える影響を調査した。さらに、異なる供給元、投与方法、および用量がApoE−/−マウスに与える影響も検討した。
結果：NMN（300 mg/kg）およびNR（230 mg/kg）の経胃投与により、体重、血清脂質、脂肪肝は減少したが、異なる供給元からの4か月の投与後、ApoE−/−マウスにおいて動脈硬化が悪化した。すでに動脈硬化プラークを持つApoE−/−マウスに対して、異なるNMN投与方法（経胃投与と飲水投与）を2か月間行ったところ、動脈硬化はさらに悪化した。NMNの影響は用量依存的であり、約100 mg/kgの用量では動脈硬化に対する有害な影響はほとんど見られなかった。
結論：NMNおよびNRは脂質異常症および脂肪肝を改善する一方で、ApoE−/−マウスでは動脈硬化を促進する可能性がある。これらの知見は、NMNの臨床試験における安全な用量設定の重要性を強調している。
1. はじめに
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）は、細胞のエネルギー代謝やDNA損傷修復、エピジェネティックな修飾、オートファジー、老化といった生理過程において不可欠なピリジン化合物である。哺乳類細胞では、NAD⁺は主にサルベージ経路を通じて合成される。
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は、ニコチンアミド（NAM）からNAD⁺生合成の律速酵素であるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Nampt）によって合成される。また、ニコチンアミドリボシド（NR）からも、ニコチンアミドリボシドキナーゼ（NRK）によるリン酸化反応を経て、さらにニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（NMNAT）によってNAD⁺に変換される。
数多くの動物実験により、NMNを定期的に補給することで、肝臓、脂肪組織、心臓、大動脈、脳などの末梢組織においてNAD⁺の生合成が効果的に促進されることが示されている。NMN補給は、グルコースおよび脂質代謝の調節、神経保護、抗老化など、様々な重要な生理機能に有益な効果を示し、顕著な治療的可能性を有している。
動脈硬化は慢性的な炎症性疾患であり、主に大・中動脈に脂質が蓄積することで進行する。これは心筋梗塞や脳卒中など主要な心血管疾患に共通する基盤的な病理変化である。脂質異常症、内皮機能障害、肥満は動脈硬化性プラークの形成を促進する要因である。
近年では、脂肪肝と動脈硬化の関連性が多くの臨床研究で明らかになっており、肝臓への過剰な脂質蓄積が炎症反応を促し、インスリン抵抗性を高め、肝臓におけるコレステロール輸送機構を阻害することで、血管疾患のリスクが増大することが示されている。
このように脂質代謝異常が動脈硬化の発症に重要な役割を果たすため、臨床ではスタチン、コレステロール吸収阻害薬、PCSK9阻害薬などの脂質低下薬が治療の柱となっている。
一方、近年の研究では、NMNやNRの補給が高脂肪食（HFD）による耐糖能障害や脂質異常症の改善に有効であることも報告されている。しかしながら、それらが動脈硬化に与える影響については、依然として意見が分かれている。
一部の研究では、NMNやNRの外因性補給によりNAD⁺の生合成が活性化され、動脈硬化に対する保護効果があるとされている。試験管内試験では、CD73経路を通じて内皮細胞中のNAD⁺濃度を調節し、内皮炎症を抑制し血管拡張機能を改善することが示された。また、老化マウスの血管SIRT1活性を回復させ、酸化ストレスを低下させ、内頸動脈の拡張障害を回復し、加齢関連の血管機能障害を抑制する効果も報告されている。加えて、一部の老化マウスの大動脈におけるmiRNAの発現プロファイルがNMN処理により正常化され、一酸化窒素の生体利用率が向上し、動脈硬化が抑制されることも報告されている。
しかしながら、NAD⁺に依存する生化学的代謝反応には複雑な経路間の相互作用が存在し、Nampt–NAD軸の役割については矛盾する結果も存在している。たとえば、頸動脈硬化症の患者では血清Nampt濃度が有意に上昇している。Nampt発現を抑制することでCXCL1を介した好中球の活性が低下し、プラーク中の炎症が軽減されることが示されている。
また、ApoE−/−マウスにおいてNamptを特異的にノックダウンすることでコレステロールの逆転送が促進され、動脈硬化が軽減されるとの報告もある。我々の以前の研究では、Namptを全身的に過剰発現させると、炎症レベルが著しく上昇し、動脈硬化が悪化することも示された。
世界的なガイドラインでは、動脈硬化の薬物療法において、長期的・個別化・予防的な対応の必要性が強調されている。しかしながら、NMNおよびNRのヒトにおける薬理効果は非常に複雑であり、その理解は未だ不十分である。特に、これまでの研究ではNMNおよびNRの投与量についてあまり考慮されてこなかった。過剰なNMN摂取は、NAD⁺の必要量を大きく超え、代謝的負担となる可能性がある。
現在、NMNはサプリメントとして一般に50〜150 mg/日、NRは最大1 g/日で使用されている。そのため、長期的な投与による副作用を十分に評価する必要がある。また、NMNの代謝は組織特異的であり、すべての人に適しているとは限らない。特に、NMNの主な摂取対象である高齢者は動脈硬化のリスクが高いため、安全性への配慮が求められる。
したがって本研究では、HFDを与えたApoE−/−マウスを用いて、NMNおよびNRの長期投与が血清脂質、肝臓の状態、動脈硬化に与える影響を明らかにすることを目的とした。また、異なる投与方法および用量についても初めて系統的に検討し、比較的安全なサプリメント応用および臨床試験の基盤となるデータを提供することを目指した。
2. 結果
2.1. NMNおよびNRは高脂肪食を与えたC57BL/6Jマウスの脂質異常症および脂肪肝を改善する
本実験では、複数の供給元から提供された製品を使用して比較研究を行いました。NMN1はSYNCOZYMES社（中国・上海）から、NR1はNatural Field Bio-Technique社（中国・西安）から、NMN2およびNR2はEffePharm社（中国・上海）から、NMN3はBontac Bio-engineering社（中国・深圳）から提供されました。
高脂肪食（HFD）を1ヶ月間与えたC57BL/6Jマウスに対し、NMN1（300 mg/kg）、NMN2（300 mg/kg）、NR2（230 mg/kg）を経口投与し、対照群には水を投与しました。その結果、体重および体重増加量は3つの投与群すべてで有意に減少しました（p < 0.05）。一方で、摂食量と血糖値には有意な差は見られませんでした。
血清脂質（トリグリセリドTG、低密度リポタンパク質LDL-c、高密度リポタンパク質HDL-c、非エステル化脂肪酸NEFA）についても測定が行われ、LDL-cは投与群で低下しましたが、他の脂質指標には有意差は認められませんでした。また、LDL-c/HDL-c比は低下した一方で、TG/HDL-c比には変化がありませんでした。
我々の過去の研究では、NRの投与がHFD誘導性の肝脂肪変性を抑制することが示されています。本研究でも、1ヶ月の投与により肝臓の重量が有意に減少し、肝臓重量/体重比も減少傾向を示しました。Oil Red O染色およびHE染色によって、NMNおよびNR投与が肝臓の脂肪蓄積や組織障害を軽減することが確認されました。
2.2. NMNおよびNRは高脂肪食を与えたApoE−/−マウスにおいて脂質異常症および脂肪肝を改善する
ApoE−/−マウスに4ヶ月間高脂肪食を与えながら、NMN1（300 mg/kg）およびNR1（230 mg/kg）を経口投与した結果、体重増加の傾向は抑えられ、特にNR1では12週および16週で有意な減少が認められました。血糖値や摂食量には大きな差は見られませんでした。
血清脂質もNMN1の方がNR1より効果的にTG、TC、LDL-c、NEFAを低下させました。TG/HDL-cおよびLDL-c/HDL-c比も低下し、肝重量の減少、脂質の蓄積抑制、肝障害の軽減といった肝機能の改善も確認されました。
2.3. NMNおよびNRは高脂肪食を与えたApoE−/−マウスにおいて動脈硬化を促進する
しかしながら、同じApoE−/−マウスでは、NMN1およびNR1の投与によって動脈硬化（アテローム性プラーク）の進行が認められました。大動脈および大動脈洞におけるプラーク面積や壊死コア数が増加しました。
この影響を検証するため、別の供給元のNMN2およびNR2を用いた4ヶ月間の投与実験でも、同様に動脈硬化の悪化が確認され、特にNR2の方が影響が強い傾向にありました。
<h4 class="title-m mt-40">2.4. 他の投与プロトコルでもNMNによる動脈硬化悪化が確認された</h4>
NMN1を2ヶ月間投与（HFD開始から2ヶ月後に投与開始）したところ、動脈硬化が有意に悪化。また、NMN3を飲料水に混ぜて投与した場合も同様に、大動脈および大動脈洞でのプラーク増加や壊死コアの増加が確認されました。
2.5. NMNの低用量では動脈硬化への影響が抑えられる
高用量（300 mg/kg）では動脈硬化を促進したNMNですが、低用量（10, 30, 100 mg/kg）では影響が抑えられることが分かりました。TGおよびLDL-cの改善、肝重量の軽減などの効果は100 mg/kgで見られましたが、動脈硬化指標では有意な悪化は見られず、比較的安全な用量であると考えられます。
3. 考察
NMN（ニコチンアミドモノヌクレオチド）は、野菜、果物、肉、魚介類などの天然食品に広く存在しています。長年の開発と継続的な努力により、NMNの合成は徐々に改良され、栄養補助食品（ニュートラシューティカル）として市場に出回るようになりました。
NMNは、肥満、虚血再灌流傷害、脳卒中、老化などの疾患において有望な応用が期待されており、NMNを有効成分とする医薬品の開発は医療のホットトピックとなっています。動物実験では、NMNは主に血管内皮依存性の血管拡張の促進や酸化ストレス・炎症反応の軽減を通じて心血管保護効果を示していることが実証されています。
同時に、NMNの投与はアンチエイジング、グルコース代謝の改善、心血管疾患の補助治療として臨床試験でも有望な戦略と考えられています。しかし、現在行われている臨床試験の多くは、NMNの栄養補助効果に焦点を当てており、薬理作用に関する研究は限定的です。また、適切な投与量と投与タイミングの選択についてもさらなる議論が必要です。
NMNは、血中脂質の低下、脂肪肝の改善、グルコース耐性の改善、インスリン感受性の向上といった効果を示しており、これらはいずれも動脈硬化の進行と関連があります。また、NMNの長期投与（12か月）は、加齢に伴う体重増加の抑制に用量依存的な効果を示しています。
NR（ニコチンアミドリボシド）も、肥満の抑制、白色脂肪組織の炎症・線維化の防止、酸化的代謝の促進などを通じて、肥満に対して保護的に作用することが知られています。
本研究では、C57BL/6Jマウスにおいて、1か月間のNMNおよびNR投与により体重減少が確認されました。ただし、ApoE−/−マウスにおける長期投与の体重変化については明確な結論は得られず、時間点によって統計的に有意な変化が認められるにとどまりました。この違いは、遺伝的背景や年齢、用量、製造会社の違いによる可能性があり、さらなる研究が必要です。
また、インスリン分泌の増加と感受性の改善が老化マウスや糖尿病モデルで報告されているにもかかわらず [8]、本研究では明確な血糖低下作用は確認できませんでした。この乖離は、血糖測定のタイミングやモデル動物の違いに起因する可能性があります。
さらに、ApoE−/−マウスにおいても、血中脂質指標の改善と脂肪肝の軽減が確認されましたが、一方で本研究はNMNおよびNRが動脈硬化を悪化させるという新たな知見を初めて示しました。
NR2はNMN2よりも強い悪化効果を示した一方で、NR1にはその傾向が見られませんでした。さらに、すでに動脈硬化プラークを形成したマウスにおいてもNMNが症状を悪化させることが、投与方法（経口・飲水）を問わず確認されました。
本研究では以下のような動脈硬化悪化のメカニズムが考察されています：
血中脂質低下と局所的脂質蓄積の乖離：血中脂質を下げながらも、血管内での脂質蓄積を促す可能性。
SIRT1経路の活性化と組織依存性効果：組織によっては炎症マーカー（IL-1、CCL2）の発現が上昇する可能性。
SARM1経路との関係：NMNがSARM1を活性化し、未変換のNMNの蓄積によって毒性を示し得る 。
高用量による代謝負荷：NRでも同様に、肝臓におけるCD38の発現上昇とSIRT1の低下によって動脈硬化が促進されたという報告があります。
最後に、ヒトへの換算用量としては、NMN 300 mg/kg → 24–33 mg/kg、NR 230 mg/kg → 18–26 mg/kg 相当とされます [41,42]。このことからも、NMNの安全な用量の見極めが極めて重要であり、本研究では100 mg/kg（ヒト換算で8–11 mg/kg）が、効果がありつつ動脈硬化への有害性がない範囲として適切であると示唆されています。
実際、最近の臨床試験では、健康成人に対して最大900 mg/日までNMNが投与され、有意なNAD+増加と副作用の欠如が確認されていますが [43]、動脈硬化を持つ高齢者では慎重な用量管理が必要です。今後の展望として、異なる背景を持つ被験者群を対象としたNMNの用量別臨床試験が必要です。
4. 材料および方法
4.1. 動物とグループ分け
C57BL/6JマウスはSippe-Bk Lab Animal Co., Ltd.（上海、中国）から購入した。ApoEノックアウトマウス（ApoE−/−）はCRISPR/Cas9によるゲノム編集により作製され、Model Organisms Center Inc.（上海、中国）またはCyagen Biosciences（蘇州、中国）から購入された。簡単に述べると、ApoE遺伝子はマウス第7染色体に位置し、4つのエクソンが存在する。開始コドンATGはエクソン2に、終止コドンTGAはエクソン4に存在し、エクソン2〜4を標的領域としてCas9およびgRNAを受精卵に共注入して作製された。
すべての実験動物（体重20–30 g）はランダムに各群に分けられた。動物は換気付きケージで12時間の明暗サイクル下に自由に飼育された。一部の実験前には、1%ペントバルビタールナトリウムによる腹腔内深部麻酔を施した。すべての動物実験は、NIHの「実験動物の取扱いに関するガイドライン」に従い、海軍医科大学の倫理委員会により承認された。
4.2. 薬剤
文献報告において、マウス実験に用いられるNMNの一般的な投与量は300または500 mg/kgである。本研究では300 mg/kgを初期投与量とした。NMNの分子量が334.2 g/mol、NRの分子量が255.3 g/molであるため、モル濃度を揃えるためにNRは230 mg/kgとした。NMN1、NMN2、NMN3の化学式はいずれもC11H15N2O8Pで等価であり、NR1およびNR2もC11H15N2O5で等価である。構造式は図13に示す。NMNおよびNRは異なる企業から提供され比較に使用された。
4.3. 体重および摂食量の測定
ApoE−/−およびC57BL/6Jマウスには動脈硬化性の高脂肪食（HFD）が与えられた（Puluteng Biotechnology Co., Ltd.製）。摂餌頻度は週2〜3回で、体重は2週間ごとに測定された。体重変化は次式で算出：
体重変化率 = (最終体重 − 初期体重)/初期体重 × 100%。摂餌量は初期餌重量−残餌重量を日数とマウス数で割って算出された。
4.4. 動脈硬化病変の解析
大動脈を顕微鏡下で下肢の総腸骨動脈まで分離し、心臓や腎臓および脂肪を除去。Oil red O染色後、Image-Jにて病変面積を解析した。
4.5. 凍結切片と染色
−20°Cで30分冷却後に10–20 μm厚で凍結切片を作製。HE染色とOil red O染色を順次行い、顕微鏡で観察。各標本から少なくとも2枚の切片を染色し、5つの異なる視野を撮影。
4.6. 血糖値の測定
12時間絶食後、尾部を1–2 mmカットし、2滴目の血液を用いて血糖測定器（Sinocare Inc.）で測定。
4.7. 血清脂質の測定
完全麻酔後に血液を心臓静脈洞から採取し、血清を得た後、TG、LDL-c、HDL-c、NEFAを自動生化学分析装置で測定。キットは南京建成バイオエンジニアリング研究所製を使用。
4.8. 肝臓の測定
麻酔後に肝臓を摘出、洗浄し重量測定。切片作成後、Oil red OおよびHE染色を実施。Leica社製顕微鏡で撮影、Image-Jにより脂質面積比を定量。
4.9. 統計解析
GraphPad Prism v12.0を使用。データは平均±標準誤差で表現。2群間の比較は両側t検定、3群以上は一元配置分散分析（ANOVA）を用い、p < 0.05を有意とした。
5. 結論
本研究において、NMN（300 mg/kg）およびNR（230 mg/kg）を経口投与した結果、体重、血清脂質、および脂肪肝が減少する一方で、ApoE−/−マウスにおいて動脈硬化が悪化することが明らかになりました。さらに、すでにプラークを有するApoE−/−マウスに対して、異なるNMNの投与方法（経口投与または飲水投与）を2か月間実施した結果、動脈硬化の進行が確認されました。
NMNの影響は用量依存的であり、おおよそ100 mg/kgの投与量では動脈硬化への有害な影響は最小限に抑えられることが分かりました。したがって、NMNおよびNRは脂質異常症および脂肪肝を改善するものの、ApoE−/−マウスにおいて動脈硬化を悪化させる可能性があるという重要な知見が得られました。
この結果は、NMNを対象とした臨床試験において安全な投与量を設定することの重要性を強調しています。特に、動脈にプラークを有する高齢者に対しては、NMNの長期摂取により動脈硬化が悪化するリスクがあるため、より慎重な対応が必要です。
