元論文：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0960852425003165
要旨
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は、NAD(P)+ 代謝における生理活性化合物であり、医薬品として多様な関心を集めています。しかし、NMN の生合成を強化するには、細胞増殖との競合や細胞内レドックス恒常性の乱れといった課題があります。本研究では、機械学習（ML）によって導かれた補酵素工学戦略を用いて、大腸菌における中心炭素代謝を再プログラムし、NMN 生産を向上させました。
NMN 生合成関連経路の工学的改変により、炭素フラックスがNMNへと向けられ、NADPHレベルが73%増加し、NMN収量（2.45 g/L）が向上しましたが、同時に細胞増殖が阻害されました。そこで、クオラムセンシング（QS）制御の補酵素工学システムを構築し、MLモデルで最適化することで、レドックスバランスの崩れに対処しました。その結果、細胞増殖が改善されつつNMN収量は3.04 g/Lに増加しました。最終的に得られた株「S344」は、フェドバッチ発酵において20.13 g/L のNMNを産生しました。
本研究は、補酵素レベルの乱れがNMN生合成の主要な制限因子であることを明らかにし、細胞内のレドックス状態を効率的に操作するためのML指導型の新しい戦略を提案しています。
はじめに
ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）は生理活性を持つヌクレオチド誘導体であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）[NAD(P)+] の生合成における重要な前駆体です。動物モデルにおける研究では、NMNが老化防止、神経保護、膵島機能障害の改善など、さまざまな健康効果を持つことが確認されています
こうした治療効果により、NMNは健康補助食品や栄養製品における有用な添加剤として注目されています。さらに、NMNは非標準の酸化還元補酵素として、高価なNAD(P)+の代替となり得ることから、工業的なバイオ触媒プロセスの実現可能性を高める手段としても期待されています。
こうした需要の増加を背景に、近年ではNMNの効率的なバイオ生産に関する研究が活発に進められています。現在、フェドバッチ発酵や全細胞触媒法が、製品の選択性が高く、環境負荷が低いことから広く利用されています。
NMNは、ナイアシンモノヌクレオチド（NaMN）、ニコチンアミドリボシド（NR）、ニコチンアミド（NAM）など、さまざまな供与体から生合成できます。たとえば、Blackらは、Francisella tularensis 由来のNMN合成酵素を組み込んだ大腸菌株により、NaMNとグルコースから細胞内NMNを1077 μmol得ることに成功しました。
また、Heらは、ヒト由来ニコチンアミドリボシドキナーゼIIを酵母の細胞表面に発現させ、NRとATPから12.6 g/LのNMNを生産しました。
さらに、NAMとホスホリボシルピロリン酸（PRPP）は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（NAMPT）によってNMNに変換されます。高活性のNAMPTをスクリーニングし過剰発現させることで、NMN収量が効果的に向上し、この経路は工業スケールのNMN生産における有力候補とされています。
この経路においては、PRPPの供給（ペントースリン酸経路の中間体）がNMN合成にとって不可欠です。しかし、PP経路を強化すると、グルコース1モルからPRPP1モルを合成するたびにNADPHが2モル生成され、これが細胞増殖と製品合成の両方に悪影響を与えることが知られています。また、NMNの過剰蓄積は、NAD(P)+代謝の自然な制御系に干渉する可能性があります。
補酵素レベルの変動は、シャーシ細胞のエネルギーおよび炭素代謝に大きな影響を与え、製品の収量と収率を低下させる可能性があります。このような問題に対し、脱水素酵素やトランスヒドロゲナーゼの過剰発現による補酵素工学は、細胞内レドックス状態の調整手段として有効であり、NAD(P)Hを補酵素とする有用化学物質の生産向上に活用されています。
補酵素工学システムの発現強度もまた、製品合成に大きな影響を与えます。たとえば、天然プロモーターで駆動されるpntAB（ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子）1コピーでは、L-ホモセリン合成に十分なNADPHを供給できませんでしたが、Ptrcプロモーターで制御された2コピーのpntAB導入により、L-ホモセリン収量が約50%増加しました。
また、NMN生合成に応じて細胞内NAD(P)Hレベルが変動する可能性があることから、補酵素工学システムの動的な発現制御が、レドックスバランスの維持において重要です。そのための手段として注目されるのがクオラムセンシング（QS）です。QSは経路非依存型の遺伝子制御回路であり、外部インデューサーを必要とせず、細胞密度の増加に応じてオートインデューサーが蓄積されることで、タンパク質分解や代謝再プログラミングなどのプロセスが活性化されます。しかし、これまでに補酵素工学がNMN生産に及ぼす影響を系統的に研究した例は存在していません。
本研究では、大腸菌においてNMN生合成関連の代謝ネットワークを系統的に設計し、動的に制御される補酵素工学システムを導入してNMNの効率的な生産を実現しました。中心炭素代謝の再プログラミングにより、炭素フラックスがNMNへと導かれましたが、同時に補酵素レベルの変動が生じ、細胞成長とNMN生産の主なボトルネックとなりました。
この問題に対応するため、QS制御の補酵素工学システムを構築し、さらに機械学習（ML）を用いたプロモーターおよびリボソーム結合部位（RBS）の設計によって最適化を図りました。1700種類以上の組み合わせからいくつかのプロモーター-RBS組み合わせを選別し、最も優れた組み合わせでは、細胞成長の回復とNMN収量20.13 g/L（5Lバイオリアクター）を達成しました。
本研究は、補酵素バランス（レドックス状態）の維持がNMN生合成にとって極めて重要であることを初めて示し、機械学習に基づく補酵素操作戦略がターゲット物質のバイオ生産において有効であることを明らかにしました。
菌株と培養条件
プラスミド構築には E. coli DH5α、代謝工学の出発株には E. coli BL21(DE3) を使用しました。接種には、E. coli を37℃、220 rpmでLuria Broth（LB）培地にて培養しました。
必要に応じて、抗生物質による選択のために以下を培地に添加しました：
スペクチノマイシン（Spe）50 μg/mL
カナマイシン（Kan）50 μg/mL
クロラムフェニコール（Cm）25 μg/mL
また、誘導には 0.5 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG） を添加しました。
NMN生合成関連経路の改変によるNMN生産および補酵素レベルの向上
大腸菌（E. coli） において、NMN（ニコチンアミドモノヌクレオチド）は主にヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼによってNAD⁺から合成されますが、この経路はNAD⁺代謝が細胞によって厳密に制御されているため、NMNの過剰蓄積が妨げられます。
外来性の経路を導入することで、NMNの生合成が強化され、細胞内の制御を回避することが可能です。NAMPT（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）は、NAM（ニコチンアミド）とPRPP（5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸）からNMNを合成する有効な酵素であり、遺伝子改変株でのNMN生産に広く利用されています。
結論
本研究では、代謝の再プログラミングと機械学習（ML）による補酵素工学を組み合わせた相乗的アプローチにより、大腸菌（E. coli） におけるNMN（ニコチンアミドモノヌクレオチド）の生合成を強化する手法を示しました。
中心炭素代謝の再設計により、炭素フラックスがNMNの生合成経路に再配分され、さらにクオラムセンシング（QS）制御による補酵素工学システムが過剰なNADPHの蓄積を緩和することで、バッチ培養における細胞増殖およびNMNの生産量が向上しました。
この研究は、NMNの効率的な生合成には細胞内の酸化還元恒常性の維持が極めて重要であることを強調しています。
